DNA-test

Ian H. Lambert – Marts 2008  

Ved årsskiftet 1998/1999 blev den traditionelle afstamningskontrol i hesteavlen ved hjælp af blodtype-bestemmelse afløst af kontrol ved hjælp af en DNA-test. Ved en DNA-test benytter man sig af et individs genetiske anlæg (DNA), der normalt koder for individets udvikling, skal kunne genfindes i faderens og/eller moderens genetiske anlæg.

Som vist i det efterfølgende diagram involverer en DNA-test følgende trin:

·        Udtagning af hårprøve fra ponyen – indsendelse af hårprøven til blodtypekontoret

·        Isolering af hårceller fra hårprøven – oprensning af DNA fra hårcellerne

·        Opformering af DNA ved PCR-teknik – opbevaring af DNA i DNA-banken til senere brug

·        DNA-test – sammenligning af DNA-mikrosatelitter fra ponyen med DNA-mikrosatelitter fra ponyens fader og moder

Udtagning af hårprøve fra ponyen

Fordelen ved en DNA-test er, at den kan udføres på hvide blodlegemer, blodplader, sædceller, hårceller, tarmceller, celler fra mundhulen ja hvilken som helst celletype - cellen skal blot indeholde en cellekerne, hvori DNAet befinder sig. I shetlandsponyregi benytter vi os af en hårprøver udtaget fra ponyens man eller hale. Som vist i Figur 1, dannes kroppens hår udfra hårpapillen, som sidder nede i bunden af en hårsæk. Hårpapilen er en vækstzone beklædt med levende celler, der deler sig i et raskt tempo. Hvis man vil vide hvor dybt hårpapillen rent faktisk ligger ned i huden kan man f.eks. tage fat med en pincet på et af overlæbens skæghår og rykke til! Når dyrlægen tager en hårprøve til DNA bestemmelse skal han sørge for at hårpapillerne kommer med, idet disse hårpapiller indeholder de levende celler hvori det genetiske materiale (kromosomer / DNA) befinder sig. Når en celle dør skal man vide, at det genetiske materiale nedbrydes og bliver ubrugeligt. Man skal også være opmærsom på at visse former for shampoo og sæbe ødelægger DNAet – det kan i praksis betyde at en hårprøve udtaget på en showdag kan have DNA, der er ødelagt i forbindelse med vask og klargøring af ponyen.

Figur 1. Håret dannes af hårcellerne, der sidder på hår-papillen. I forbindelse med hårcellerne sidder der melanocytter, som danner farvepimentet. DNA, der isoleres fra hårceller og pigmentceller er fuldstændigt identisk med det DNA man kan ekstrahere fra fra celler i resten af kroppen.

PCR-reaktionen – lidt DNA bliver til meget DNA.

Ved udtagning af en hårprøve satser man på at trække 10 - 20 hår ud. Hårprøven sendes til blodtypelaboratoriet, hvor man meget omhyggeligt klipper hårpapillerne fri fra håret og opsamler dem i et forsøgsrør. De levende celler ”smadres” hvorefter man isolerer cellekerne, som indeholder vores DNA. Ved næste trin ekstraheres alt DNAet over i et nyt glas. Mængden af DNA man kan udtrække af 10 - 20 hårpapiller er ret begrænset, men dette er ikke noget problem idet man ved en serie biokemiske reaktioner kan mangfoldiggøre den DNA, som var i den oprindelige hårprøve. Teknikken, der benyttes, hedder Polemerase Chain Reaction som forkortes PCR. Ved denne PCR reaktion benytter man sig af at DNA er en dobbelstrenget helix og at der ved reaktionens forløb dannes en tro kopi af det oprindelige DNA materiale. Ved to på hinanden følgende PCR reaktioner dannes der 2*2 = 4 kopier af det oprindelige DNA materiale. Ved 5 på hinanden følgende PCR reaktioner dannes der 2*2*2*2*2 = 32 kopier af det oprindelige DNA materiale (se Figur 2). Har man lidt DNA materiale i sit udgangsmateriale skal man blot lade PCR reaktionen forløbe mange gange så vil man til sidst opnå den mængde DNA, der kræves for at gennemføre det egentlige DNA test. PCR-reaktionen er en automatiseret teknik og mængden af DNA man kan få ud i den sidste ende begrænses kun af økonomien, idet de enzymer, der skal benyttes, er ret dyre.

Figur 2. Ved PCR-tekning øges antallet af DNA kopier og teknikken benyttes til at opformere en lille mængde DNA til en stor mængde DNA. Ved hver cyklus fordobles mængden af DNA.

Når man har oprenset og mangfoldiggjort DNA fra ponyen kan man putte DNAet i DNA-depotet til senere brug eller sende det med posten til et andet land. I praksis betyder dette, at skal blodtypelaboratoriet teste en pony hvis fader står i f.eks England så sender man en e-mail med anmodning om en DNA-prøve for den pågældne hingst fra DNA-banken i England – når DNA prøven er modtaget med posten vil man ofte foretage en PCR reaktion og således opformere mængden af DNA dels til opbevaring i den lokale DNA-bank og dels til testen for afstamning.

DNA-mikrosatelitter røber individets identitet  

Ved analyse af det enkelte individs DNA viser det sig, at det indeholder korte sekvenser – de såkaldte DNA-mikrosatelitter. Disse DNA-mikrosatellitter koder tilsyneladende ikke for noget som helst i den levende organisme. Fidusen ved DNA-mikrosatellitter er at de udviser arveligt betinget variation - sagt med andre ord de DNA-mikrosatelitter, der findes hos et føl skal genfindes enten hos faderen eller hos moderen. For at kunne sammenligne DNA-mikrosatellitter fra faderen, moderen og afkommet ekstraherer man enten DNA fra en hårprøve fra hver af ponyerne eller om muligt henter en DNA prøve fra DNA-banken. Ved hjælp af PCR mangfoldiggører man DNA-mikrosatellitterne.

Figur 3. Ved Gel-elektroforese adskildes DNA fra hoppe, hingst og føl efter størrelse. Ved afstamningskontrol kører man altid DNA fra hoppe, hingst og føl samtidigt og i samme gel.

Ved det næste trin sorterer man DNA-mikrosatellitterne efter størrelse. Dette gøres i laboratoriet ved hjælp af såkaldt gel-elektroforese, som er vist i 3 trin i Figur 3. Trin 1: Man anbringer en såkaldt "gel", der minder om en tyk skive opblødt husblas, mellem 2 glasplader. Trin 2: Gelen har øverst nogle brønde – i disse anbringes DNA fra hoppen, hingsten og føllet. Trin 3: Glasplader, gel med DNA anbringes i et væskefyldt kammer og der monteres en elektrode for oven og forneden. Ved at gøre den nederste elektrode positiv vil man trække DNA, som er negativt ladet, ned i gelen. Store stumper af DNA vil have svært ved at bevæge sig i gelen og bevæger sig ikke ret langt. Små stumper af DNA har lettere ved at bevæge sig og når længere. Sagt med andre ord de letteste/korteste DNA stumper vandrer længst - de største/længste DNA stumper vandrer kortest vej. Man kan nu tage gelen ud af opstilligen og fremkalde den. Herved fremkommer DNA som mørke bånd. Dette er vist på Figur 4.

Figur 4. DNA-mikrosatelitter fra hoppe, hingst og føl er adskildt ved Gel-elektroforese og gelen er blevet fremkaldt næsten ligesom man gør det med et fotografi. Herved ses de enkelte DNA-mikrosatellitter som bånd. Resultatet er skematisk og DNA fra hoppe og hinst farvet med henholdsvis rødt og blåt for at lette identifikation i føllet. Bemærk at de pletter, der er hos føllet alle genfindes inten hos moder eller hos fader.

Ved afslutning af elektroforesen fremkaldes gelen hvorved DNA-mikrosatellitter bliver synlige. Man tjekker dernæst om de pletter, der findes hos føllet også findes hos enten fader eller moder. Gør de det er føllet efter de to forældre som det testet for.

Nedenfor har jeg indsat en kopi af DNA testen for Abildores Laurette. Læg mærke til at man benytter 12 DNA-mikrosatelitter og at disse har fået en kode. I nogle lande benytter man et større antal DNA-mikrosatelitter – men konklusionen på DNA-testen skulle gerne være den samme.

Andre muligheder med DNA prøven 

Det er i dag muligt udfra en DNA prøve at teste om en pony bærer et bestemt gen eller ej. For eksempel kan man i dag teste om ponyen har anlæg for rødt farvepigment eller sølv-gen. Dette er af interesse hvis man vil vide om en sort pony eller en dun pony bærer et skjult gen for rødt. Flere amerikanske firmaer annoncerer med DNA-test for farver. Det er også muligt at teste for fejl i et givet gen - man skal i dette tilfælde blot vide på hvilket kromosom og hvor på kromosomet det pågældne gen er lokaliseret. Hvad der er af stor interesse er om man inden for en overskuelig årrække ville kunne teste for gener, der regulerer fedtstofskiftet eller bevægapparatet for således at kunne teste for forfangenhed og defekter i bentøjet.